على وسائط المغذيات الاصطناعية ، يمكنك النمو

طرق زراعة الكائنات الدقيقة. دراسة ثقافية وبيوكيميائية

الخصائص

تُستخدم الزراعة ، أي زراعة الكائنات الحية الدقيقة في المختبر ، لدراسة خصائصها والحصول على الكتلة الحيوية. تُزرع البكتيريا والفطريات والفطريات الشعاعية واللولبيات وبعض الأوليات على وسط مغذٍ. يمكن أن تتكاثر الكلاميديا ​​والريكتسيا والفيروسات وبعض الأوليات فقط في جسم الحيوان أو في الخلايا الحية.

الخصائص الثقافية لهذا النوع من الكائنات الحية الدقيقة هي: 1) الشروط اللازمة للتكاثر ، و 2) طبيعة النمو على وسط المغذيات. الخصائص الثقافية هي إحدى الخصائص التي تؤخذ في الاعتبار عند تحديد (تحديد نوع) الكائنات الحية الدقيقة.

بيئة مزارع

يجب أن تفي وسائل الإعلام الثقافية بمتطلبات معينة. يجب أن تحتوي على جميع العناصر الغذائية اللازمة لتكاثر هذا النوع من الميكروبات. تنمو بعض الكائنات الدقيقة المسببة للأمراض على وسائط مغذية بسيطة ، بينما يحتاج البعض الآخر إلى إضافة الدم ومصل الدم والفيتامينات لتكاثرها.

في وسط الاستزراع ، يجب إنشاء ظروف معينة عن طريق إضافة محلول كلوريد الصوديوم أو المحاليل العازلة. بالنسبة لمعظم البكتيريا ، يفضل استخدام وسط غذائي يحتوي على 0.5٪ من كلوريد الصوديوم. تفاعل وسط المغذيات ، مواتٍ لمعظم البكتيريا المسببة للأمراض ، قلوي قليلاً ، والذي يتوافق مع الرقم الهيدروجيني = 7.2-7.4. تنمو ضمة الكوليرا عند الرقم الهيدروجيني = 7.8-8.5 ، والفطر - عند الرقم الهيدروجيني = 5-5.5. يجب أن تكون وسائط الاستنبات رطبة ، أي تحتوي على كمية كافية من الماء ، وأن تكون شفافة ومعقمة قدر الإمكان ، أي قبل البذر ، لا تحتوي على ميكروبات.

من حيث التركيب والأصل ، فإن وسائط المغذيات طبيعية وصناعية وتركيبية. وسائط الثقافة الطبيعية هي منتجات طبيعية مثل البطاطس والخضروات الأخرى. يتم تحضير وسائط المغذيات الاصطناعية وفقًا لوصفة محددة من المنتجات مع إضافة مركبات عضوية وغير عضوية. تحتوي الوسائط الاصطناعية على مركبات كيميائية معينة بتركيزات معروفة.

عن طريق الاتساق ، تكون وسائط المغذيات سائلة ، وشبه سائلة ، وكثيفة. عادة ما يستخدم Agar-agar-polysaccharide المعزول من الأعشاب البحرية كمادة مانعة للتسرب. لا تستخدم الكائنات الحية الدقيقة أجار أجار كمغذيات ؛ فهي تشكل هلامًا في الماء يذوب عند 100 درجة مئوية ويتصلب عند 45 درجة مئوية.

للحصول على وسط مغذي كثيف ، يضاف أجار أجار بتركيز 1.5-2 ٪ ، شبه سائل - 0.5 ٪.

وفقًا للغرض المقصود منها ، يمكن تقسيم وسائط الثقافة إلى تشخيص تفاضلي عادي (بسيط) ، خاص ، اختياري.

يتم استخدام الوسائط الغذائية التقليدية (البسيطة) في زراعة معظم الكائنات الحية الدقيقة ، وهذا هو مرق الميزوباتاميا (MPB) ، أجار ميزوباتاميا (MPA).

يتم استخدام وسائط مغذية خاصة لزراعة الكائنات الحية الدقيقة التي لا تنمو على وسائط بسيطة. على سبيل المثال ، أجار الدم ومرق السكر للمكورات العقدية وأجار المصل للمكورات السحائية والمكورات البنية.

يتم استخدام وسائط الاستزراع الاختيارية لعزل نوع واحد من خليط من البكتيريا المختلفة. ينمو هذا النوع من البكتيريا في هذه البيئة بشكل أسرع وأفضل من غيره ، ويتفوق عليهم في نموه ؛ يتأخر نمو البكتيريا الأخرى على هذا الوسط. على سبيل المثال ، مصل متخثر لعصيات الخناق ، وماء ببتون قلوي لكوليرا فيبريو ، ومرق صفراوي لعصيات التيفوئيد ، ووسط ملحي للمكورات العنقودية.

تُستخدم وسائط الثقافة التشخيصية التفاضلية لتمييز بعض أنواع البكتيريا عن غيرها من خلال نشاطها الأنزيمي (انظر القسم المقابل).

زراعة وعزل الثقافات النقية من البكتيريا الهوائية

لزراعة الكائنات الحية الدقيقة ، هناك شروط معينة ضرورية: درجة الحرارة ، والظروف الهوائية أو اللاهوائية.

يجب أن تكون درجة الحرارة الأمثل للأنواع. تزدهر معظم البكتيريا المسببة للأمراض عند 37 درجة مئوية. ومع ذلك ، بالنسبة لبعض الأنواع ، تكون درجة الحرارة المنخفضة هي الأمثل ، والتي ترتبط بخصائص بيئتها. لذلك ، بالنسبة لعصيات الطاعون ، الموطن الطبيعي للقوارض أثناء السبات ، فإن درجة الحرارة المثلى هي 28 درجة مئوية ، كما هو الحال بالنسبة لبيروسبيرا ، لعصيات التسمم الغذائي - 28 درجة مئوية - 35 درجة مئوية.

بالإضافة إلى درجة الحرارة المثلى ، لزراعة الكائنات الحية الدقيقة ، اعتمادًا على الأنواع ، يلزم وجود بيئة هوائية أو لا هوائية.

من أجل دراسة التشكل والخصائص الثقافية والكيميائية الحيوية وغيرها من خصائص الميكروبات ، من الضروري الحصول على ثقافة نقية. عادة ما تسمى ثقافة الميكروبات بتراكمها على وسط غذائي في شكل تعكر ، أو نمو قريب من القاع (جدار) أو فيلم على سطح وسط سائل أو مستعمرات على وسط كثيف. تتكون مستعمرة واحدة من خلية جرثومية واحدة. الثقافة النقية هي ثقافة الميكروبات من نفس النوع التي يتم الحصول عليها من مستعمرة واحدة. في المختبرات ، يتم استخدام سلالات معينة معروفة من الميكروبات في دراسات مختلفة. السلالة هي مزرعة نقية للميكروبات تم الحصول عليها من مصدر معين ، في وقت محدد ، بخصائص معروفة. عادة ، يتم تحديد السلالات الميكروبية برقم محدد. على سبيل المثال ، تُستخدم سلالة Staphylococcus aureus 209P لتحديد نشاط البنسلين.

عادةً ما يستغرق عزل المزارع النقية للأيروبس ثلاثة أيام ويتم تنفيذه وفقًا للمخطط التالي:

اليوم الأول - الفحص المجهري لمسحة من مادة الاختبار ، ملطخة (عادة بالجرام) - للتعرف الأولي على البكتيريا ، والتي يمكن أن تكون مفيدة في اختيار وسط الثقافة للتلقيح. ثم تلقيح المادة على سطح أجار المغذيات المجمدة للحصول على مستعمرات معزولة. يمكن إجراء النخل وفقًا لطريقة Drygalsky في ثلاثة أطباق بتري مع وسط غذائي. توضع قطرة من مادة على الكوب الأول وتنتشر بملعقة فوق الكوب بأكمله. ثم ، باستخدام الملعقة نفسها ، وزع المزرعة المتبقية عليها على الكوب الثاني وبنفس الطريقة على الكوب الثالث. سوف ينمو أكبر عدد من المستعمرات في الصفيحة الأولى ، والأقل في الصفيحة الثالثة. تنمو المستعمرات المعزولة على إحدى الصفائح ، اعتمادًا على عدد الخلايا الميكروبية الموجودة في مادة الاختبار.

يمكن تحقيق نفس النتيجة بالغربلة في كوب واحد. للقيام بذلك ، قسّم الكوب إلى أربعة أقسام. يتم تلقيح المادة قيد الدراسة بحلقة جرثومية بضربات على القطاع الأول ، وبعد ذلك ، بعد تكليس الحلقة وتبريدها ، يتم توزيع التلقيح من القطاع الأول إلى القطاع الثاني وبنفس الطريقة بالتتابع في القطاعين الثالث والرابع. تتشكل المستعمرات المعزولة من خلايا ميكروبية فردية بعد الحضانة اليومية في منظم الحرارة.

اليوم الثاني - دراسة المستعمرات المزروعة على الأطباق ووصفها. يمكن أن تكون المستعمرات شفافة أو شفافة أو غير شفافة ، ولها أحجام مختلفة ، ومخططات دائرية منتظمة أو غير منتظمة ، ومحدبة أو مسطحة ، وسطح أملس أو خشن ، وحواف ناعمة أو متموجة ، وخشنة. يمكن أن تكون عديمة اللون أو بيضاء ، ذهبية ، حمراء ، صفراء. بناءً على دراسة هذه الخصائص ، يتم تقسيم المستعمرات المزروعة إلى مجموعات. ثم يتم اختيار مستعمرة معزولة من مجموعة الدراسة ، ويتم إعداد مسحة للفحص المجهري للتحقق من تجانس الميكروبات في المستعمرة. يتم تلقيح نفس المستعمرة في أنبوب اختبار بأجار مغذي مائل.

اليوم الثالث - التحقق من نقاء الثقافة المزروعة على ميل أجار بواسطة الفحص المجهري. مع تجانس البكتيريا المدروسة ، يمكن اعتبار عزل الثقافة النقية كاملاً.

لتحديد البكتيريا المعزولة ، يتم دراسة السمات الثقافية ، أي طبيعة النمو على وسائط المغذيات السائلة والصلبة. على سبيل المثال ، تشكل المكورات العقدية على مرق السكر رواسب قاع وجداري ، على أجار الدم - مستعمرات صغيرة دقيقة ؛ تشكل ضمة الكوليرا فيلمًا على سطح ماء الببتون القلوي ، ومستعمرات شفافة على أجار قلوي ؛ تشكل عصيات الطاعون الموجودة على أجار المغذيات مستعمرات على شكل "مناديل دانتيل" ذات مركز كثيف وحواف متموجة رفيعة ، وفي وسط مغذي سائل - غشاء على السطح ، ثم خيوط ممتدة منه على شكل "مقرنصات ".

زراعة وعزل الثقافات النقية من البكتيريا اللاهوائية

لزراعة اللاهوائيات ، من الضروري تقليل إمكانات تقليل الأكسدة للوسط ، لإنشاء اللاهوائية عن طريق إزالة الأكسجين بالطرق الفيزيائية أو الكيميائية أو البيولوجية.

تشمل الطرق الفيزيائية:

1) الإزالة الميكانيكية للهواء عن طريق مضخة من anae-rostat ، حيث توضع أطباق التلقيح. في الوقت نفسه ، يمكنك استبدال الهواء بغاز غير مبال: النيتروجين والهيدروجين وثاني أكسيد الكربون.

2) النمو في وسط يحتوي على مواد مختزلة. Kitta-Tarozzi Wednesday عبارة عن مرق سكر مع قطع من الكبد أو اللحم. الجلوكوز وأجزاء من الأعضاء لها قدرة متناقصة. يُسكب الوسط في الأعلى بطبقة من زيت الفازلين لمنع وصول أكسجين الهواء.

3) الطريقة الأبسط والأقل موثوقية هي النمو بعمق في عمود طويل من أجار السكر.

تتكون الطرق الكيميائية من حقيقة أن الأطباق التي تحتوي على محاصيل اللاهوائية توضع في مجفف محكم الإغلاق ، حيث يتم وضع المواد الكيميائية ، على سبيل المثال ، البيروجالول والقلويات ، حيث يستمر التفاعل مع امتصاص الأكسجين.

تعتمد الطريقة البيولوجية على الزراعة المتزامنة للكائنات اللاهوائية والهوائية على وسائط مغذية صلبة في أطباق بتري ، محكمة الإغلاق بعد التلقيح. أولاً ، يتم امتصاص الأكسجين عن طريق الأيروبس المتنامي ، ثم يبدأ نمو اللاهوائية.

يبدأ عزل الثقافة اللاهوائية النقية بتراكم البكتيريا اللاهوائية عن طريق التلقيح على وسط كيتا تاروزي. في المستقبل ، يتم الحصول على المستعمرات المعزولة بإحدى طريقتين:

1) يتم تلقيح المادة عن طريق خلط أجار السكر الدافئ المذاب في أنابيب زجاجية. بعد ترسيخ الأجار ، تنمو المستعمرات المعزولة في أعماقها ، والتي تتم إزالتها عن طريق قطع الأنبوب وثقافتها الفرعية على وسط Kitt-Tarozzi (طريقة Weinberg) ؛

2) يتم تلقيح المادة على ألواح ذات وسيط مغذي ويتم تحضينها في anaerostat. تتم تربية المستعمرات المعزولة التي تنمو على طبق على وسط Kitt-Tarozzi (طريقة Zeissler).

زراعة الكائنات الحية الدقيقة الأخرى

زراعة الميكوبلازما

تُزرع الميكوبلازما على وسط مغذي مكمل بمصل وكربوهيدرات. نظرًا لأن الميكوبلازما تفتقر إلى جدار خلوي ، فإنها تنمو فقط في بيئات متساوية التوتر أو مفرطة التوتر. على وسط المغذيات الصلبة ، لعدة أيام ، تتشكل مستعمرات صغيرة جدًا تشبه البيض المقلي - مع مركز محدب ومحيط شفاف مسطح. يمكن أيضًا زراعة الميكوبلازما في أجنة الدجاج أو زراعة الخلايا.

زراعة الريكتسيا والكلاميديا

الريكتسيا والكلاميديا ​​هي طفيليات ملزمة داخل الخلايا. لزراعتها ، يتم استخدام مزارع الخلايا وأجنة الدجاج والعدوى الحيوانية.

زراعة الفطر

لزراعة الفطر ، يتم استخدام وسائط المغذيات الكثيفة والسائلة: غالبًا وسط Sabouraud ، بالإضافة إلى الوسائط التي تحتوي على نبتة البيرة. ينمو الفطر بشكل أبطأ من البكتيريا ، ويشكل نموًا مرئيًا في غضون أيام قليلة. درجة حرارة الزراعة أقل من درجة حرارة البكتيريا - 22-30 درجة مئوية.

زراعة اللولبيات والأوليات

من بين اللولبيات ، من الأسهل أن تنمو اللبتوسبيرا ، حيث يمكن أن يكون الماء الممزوج بمصل دم الأرانب بمثابة وسط غذائي.تُزرع البورلية واللولبية تحت ظروف لاهوائية على وسائط مغذية أكثر تعقيدًا تحتوي على مصل ، وقطع من الأنسجة الحيوانية.

من بين البروتوزوا ، الزحار الأميبا ، اللمبلية ، المشعرات ، الليشمانيا ، المثقبيات ، البلانتيديا تزرع على وسط غذائي ، تزرع التوكسوبلازما في أجنة الدجاج ومزارع الأنسجة. طرق زراعة الملاريا المتصورة قيد التطوير.

طرق دراسة النشاط الأنزيمي (الخصائص البيوكيميائية)

في الممارسة الميكروبيولوجية ، تُستخدم دراسة النشاط الأنزيمي لتحديد الكائنات الحية الدقيقة ، نظرًا لأن كل نوع ميكروبي يحتوي على مجموعة معينة من الإنزيمات.

لتحديد نشاط التحلل ، يتم تلقيح الميكروبات بحقن في عمود من الجيلاتين ، وبعد 3-5 أيام من الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، يتم ملاحظة خاصية تسييل الجيلاتين: في شكل قمع ، مسمار ، تخزين أو على شكل شجرة عيد الميلاد المقلوبة. يتم تحديد نشاط تحلل البروتين أيضًا من خلال تكوين منتجات تحلل البروتين: الإندول ، كبريتيد الهيدروجين ، الأمونيا. لتحديدها ، يتم تلقيح الكائنات الحية الدقيقة في مرق ببتون اللحم ، وتوضع أوراق المؤشر بين عنق أنبوب الاختبار وسدادة قطنية ، باستثناء ملامستها للوسيط. عندما يتشكل الإندول ، يتحول لون الورق المشبع بمحلول مشبع من حمض الأكساليك إلى اللون الوردي ؛ في وجود كبريتيد الهيدروجين ، يتحول الورق المشرب بخلات الرصاص إلى اللون الأسود ؛ عندما تتشكل الأمونيا ، يتحول ورق عباد الشمس الأحمر إلى اللون الأزرق.

لتحديد الخصائص السكرية للميكروبات ، يتم استخدام وسائط التشخيص التفاضلي ، مثل وسائط Giss ، ووسط Olkenitsky ، ووسط Endo ، ووسط Levin ، ووسط Ploskirev.

يتم استخدام Media Endo و Levin و Ploskirev في أطباق بتري للتمييز بين بكتيريا المجموعة المعوية من خلال قدرتها على تخمير اللاكتوز. تحتوي هذه الوسائط على أجار المغذيات واللاكتوز ومؤشر يتغير لونه في وسط حمضي - مؤشر الأس الهيدروجيني. إذا زرعت بكتيريا تخمر اللاكتوز ، مثل الإشريكية القولونية ، في مثل هذه البيئة ، يتشكل الحمض نتيجة تخمر اللاكتوز ، وسيتغير لون المؤشر في بيئة حمضية. لذلك ، سيتم تلوين مستعمرات Escherichia coli على هذه الوسائط وفقًا للون المؤشر: في وسط Endo و Ploskirev - باللون الأحمر ، على وسط Levin - باللونين الأسود والأزرق. ستكون مستعمرات البكتيريا التي لا تخمر اللاكتوز ، مثل السالمونيلا وعصي الزحار ، عديمة اللون.

يتم تحضير وسائط Giss (وسائط "النطاق المتنوع") على أساس الماء الببتون أو أجار اللحم الببتون شبه السائل. تحتوي على أي كربوهيدرات أو كحول متعدد الهيدروكسيل ومؤشر. عندما ينمو ميكروب على وسط جيس ، يخمر هذه الركيزة بتكوين الحمض والغاز ، سيتغير لون الوسط ، في وسط شبه سائل ، ستظهر الفقاعات والتمزقات في سمك الآجار ، في وسط سائل - أ فقاعة غاز في تعويم زجاجي. عندما يتم تخمير الركيزة فقط إلى حمض ، يحدث تغيير فقط في لون الوسط.

يتم أيضًا استخدام الوسائط المدمجة التي لا تحتوي على كربوهيدرات واحد ، ولكن اثنين أو ثلاثة ، على سبيل المثال ، وسط Olkenitsky. يستبدل أنبوب واحد من هذا الوسيط وسائط أجار مائل و Giss باللاكتوز والجلوكوز والسكروز. بعد التعقيم في الحالة المنصهرة ، يكون الوسط في أنبوب الاختبار مائلًا بحيث يتم الحصول على عمود وجزء مشطوف. تتم البذر بضربة على الجزء المشطوف وخز في عمود. عندما يتم تخمير اللاكتوز أو السكروز ، يتغير لون الوسط بأكمله ؛ عندما يتم تخمير جلوكوز واحد ، يتغير لون العمود فقط. يشار إلى تكوين الغاز من خلال وجود فقاعات في عمود أجار. عندما تطلق الميكروبات الأمونيا ، لا يتغير لون الوسط. يتجلى تكوين كبريتيد الهيدروجين من خلال اسوداد طاولة أجار

بالنسبة للطريقة السريعة لتحديد النشاط الأنزيمي للبكتيريا ، يتم استخدام أنظمة الفحص الدقيق ونظام ورقة المؤشر (NIB)

نظام الفحص الدقيق عبارة عن وعاء مصنوع من البوليسترين الشفاف ، ويتكون من عدة خلايا. تحتوي الخلايا على وسط مغذي مجفف مع كربوهيدرات ومؤشرات الأس الهيدروجيني. يتم تلقيح مستنبت من البكتيريا ذات كثافة معينة في كل خلية. يتم سكب محلول ملحي في خلايا التحكم

مؤشر

أنظمة ورقة المؤشر (NIB) لتحديد عائلة enterobacteriaceae عبارة عن أقراص أو شرائح من الورق الكروماتوغرافي ، مغطاة بغشاء واقي وتحتوي على ركيزة محددة ومؤشر. عن طريق تغيير لون المؤشر لتحديد كبريتيد الهيدروجين ، يكون القرص يوضع على سطح MPA ، مزروع بحقنة ، مما يجعل من الممكن تحديد التنقل في وقت واحد

في جميع الأنابيب ، يتم أخذ النتيجة الأولية في نفس اليوم والنتيجة النهائية في اليوم التالي في الاعتبار.

يتم تحديد نشاط أوكسيديز عن طريق فرك المزرعة على ورقة مؤشر ، وتؤخذ النتيجة في الاعتبار بعد دقيقة.

الأنسجة المعزولة والخلايا النباتية

زراعة الخلايا والأنسجة المعزولة على وسط مغذي اصطناعي تحت ظروف معقمة (في المختبر) تلقى اسم طريقة زراعة الأنسجة المعزولة.

نظرًا لحقيقة أن نباتات البذور لها أهمية قصوى في حياة الإنسان ، فقد تم تطوير طرق وظروف زراعتها بشكل أفضل من عاريات البذور أو الطحالب ، التي تسبب زراعتها في ظروف معقمة بعض الصعوبات. ومع ذلك ، بغض النظر عن انتماء النباتات إلى مجموعة تصنيفية معينة ، هناك متطلبات عامة لزراعة الأشياء في الثقافة. في المختبر.

عقم. بادئ ذي بدء ، تتطلب زراعة أجزاء من الأنسجة أو الأعضاء النباتية - إإكسبلنتس ، وحتى أكثر من الخلايا الفردية ، عقمًا كاملاً. الكائنات الحية الدقيقة التي يمكن أن تدخل وسط المغذيات تطلق السموم التي تمنع نمو الخلايا وتؤدي إلى موت المزرعة. لذلك ، لجميع التلاعب بالخلايا والأنسجة أثناء الزراعةفي المختبر مراعاة قواعد معينة للتعقيم في صندوق رقائقي أو في غرف معقمة. في الحالة الأولى ، يتحقق التعقيم عن طريق إمداد العامل بالهواء المعقم المصفى الموجه من الصندوق الرقائقي بالخارج. يتم تعقيم الغرف المعقمة باستخدام مصابيح الأشعة فوق البنفسجية ، وتعمل في مثل هذه الغرف بملابس معقمة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تعقيم سطح العمل للطاولات في الغرف والأدوات المعقمة بالكحول قبل العمل.

يتم تعقيم الأطباق النظيفة المغلفة مسبقًا بالورق أو الرقائق ، والأدوات ، والورق ، والصوف القطني بالحرارة الجافة في فرن عند 160 درجة مئوية لمدة 1.5-2 ساعة. يتم تعقيم وسائط الثقافة في الأوتوكلاف عند 120 درجة مئوية والضغط العالي في غضون 15 - 20 دقيقة. إذا كانت وسط المزرعة تحتوي على مواد تتحلل أثناء التعقيم ، فيجب تعقيمها بالترشيح من خلال مرشح بكتيري. ثم تضاف المكونات المعقمة المفلترة إلى وسط التعقيم المبرد إلى 40 درجة مئوية.

يمكن أن تكون الأنسجة النباتية نفسها مصدرًا خطيرًا للعدوى ، حيث توجد النبتات الدقيقة المشبعة دائمًا على سطحها. لذلك فإن التعقيم السطحي مطلوب ويتم على النحو التالي. في السابق ، كان الجزء الذي سيتم استخلاص النبات منه يغسل بالماء والصابون ويشطف بالماء النظيف. ثم يتم تعقيم المواد النباتية في محاليل المطهرات. يتم عرض بعض هذه المواد وكذلك وقت التعقيم في الجدول. 6.1

الجدول 6.1 تعقيم المادة النباتية الأصلية (وفقًا لـ R.G.بوتينكو ، 1999) شيء	وقت التعقيم ، دقيقة
	دياسيد 0.1٪	كلوريد الزئبق 0.1٪	بيروكسيد الهيدروجين ، 10-12٪
البذور جافة	15-20	10-15	12-15
منتفخة البذور	6-10	6-8	6-8
الأنسجة الجذعية	20-40	20-25	—
أوراق	1-3	0,5-3	‘ 3-5
الرؤوس	1-10	0,5-7	2-7

بعد حفظ الإكسبلنتس في محلول مطهر ، يتم غسلها عدة مرات في الماء المقطر ويتم إزالة الطبقة الخارجية من الخلايا الموجودة على شرائح الإكسبلنتس بمشرط ، حيث يمكن أن تتلف أثناء التعقيم.

يمكن أيضًا العثور على الكائنات الحية الدقيقة داخل الأنسجة النباتية. العدوى الداخلية أكثر شيوعًا في النباتات الاستوائية وشبه الاستوائية. لذلك ، بالإضافة إلى التعقيم السطحي ، من الضروري في بعض الأحيان استخدام المضادات الحيوية التي تقتل الفلورا الميكروبية داخل الأنسجة. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن مثل هذا العلاج لا يؤدي دائمًا إلى تعقيم الأنسجة الداخلية ، حيث يصعب اختيار المضاد الحيوي المستهدف.

بيئة مزارع. تُزرع الخلايا والأنسجة المعزولة على وسائط مغذية متعددة المكونات. يمكن أن تختلف اختلافًا كبيرًا في تكوينها ، ومع ذلك ، فإن تكوين جميع الوسائط يشتمل بالضرورة على العناصر الدقيقة والعناصر الدقيقة اللازمة للنباتات والكربوهيدرات والفيتامينات والهرمونات النباتية ونظائرها الاصطناعية. يتم تضمين الكربوهيدرات (عادة السكروز أو الجلوكوز) في أي صيغة غذائية بتركيز 2-3٪. إنها ضرورية كعنصر غذائي ، لأن معظم أنسجة الكالس تفتقر إلى الكلوروفيل وليست قادرة على التغذية الذاتية. لذلك ، يتم تربيتها في ظروف الإضاءة المنتشرة أو في الظلام. الاستثناء هو نسيج الكالس للماندريك والقطيفة وبعض النباتات الأخرى.

يجب أن تكون المكونات التي لا غنى عنها لوسائط الاستنبات هي الأكسينات التي تسبب عدم تمايز الخلايا الجذعية والسيتوكينينات التي تحفز انقسام الخلايا. عندما تتغير النسبة بين هذه الهرمونات النباتية أو عند إضافة هرمونات نباتية أخرى ، يمكن أن تحدث أنواع مختلفة من التشكل.

يعزز المحتوى العالي من أيونات النترات والأمونيوم والبوتاسيوم والفوسفات نمو الخلايا السريع. يقلل استنفاد البيئة بشكل كبير من نمو وعمليات التمثيل الغذائي الثانوي. ومع ذلك ، فإن المحتوى المنخفض الأولي للفوسفات في وسط المغذيات يمكن أن يحفز تخليق المستقلبات الثانوية. وجد أن زراعة كالي عرق السوس على وسط بنصف تركيز النيتروجين والفوسفور في الظلام يزيد من محتوى المركبات الفينولية بمقدار 1.6 مرة مقارنة بزراعة الكالى التي تنمو على وسط كامل. يمكن إضافة السويداء للأجنة غير الناضجة (جوز الهند ، كستناء الحصان ، إلخ) ، نسغ بعض الأشجار ، مستخلصات مختلفة (الشعير ، الخميرة ، عصير الطماطم) إلى الوسط. تعريفهم بالبيئة. تعطي نتائج مثيرة للاهتمام ، ولكن من الصعب إعادة إنتاج مثل هذه التجارب ، لأن المكون النشط عادةً ما يكون غير معروف تمامًا. على سبيل المثال ، لم تؤد إضافة أجزاء منفصلة من حليب جوز الهند إلى وسط المغذيات إلى أي نتائج ، بينما تسبب السويداء غير المجزأ في انقسام الخلايا.

عند تحضير وسائط المغذيات الصلبة للزراعة السطحية لأنسجة الكالس ، يتم استخدام أجار أجار المنقى ، وهو عديد السكاريد الذي يتم الحصول عليه من الأعشاب البحرية. كأمثلة في الجدول. يوضح الشكل 6.2 التراكيب الخاصة بأكثر وسائل الثقافة شيوعًا.

تعد بيئة Murashige و Skoog هي الأكثر تنوعًا. وهي مناسبة لتشكيل الكالس ، والحفاظ على نمو الكالس غير المنتظم ، وتحريض التشكل في معظم النباتات ثنائية الفلقة. وبالتالي ، فإن التغيير في نسبة auxin و kinetin يؤدي إلى تكوين أي من الجذور (غلبة auxin) ، أو ؛ المحاصيل الجذعية (غلبة الكينيتين).

يعد متوسط ​​Gamborg و Eveleg مناسبًا تمامًا لزراعة الخلايا والأنسجة من البقوليات والحبوب ، ويوفر وسيط White * تجذير البراعم والنمو الطبيعي للساق بعد التجديد ، ووسط Nitsch و Nitsch مناسب لتحريض الأندرو-أنانشأة في ثقافة الأنثر.

العوامل الفيزيائية. لنمو وتطور الأنسجة النباتية. في المختبر العوامل الفيزيائية - الضوء ، لها تأثير كبير ؛ درجة الحرارة والتهوية والرطوبة. |

خفيفة. يمكن أن تنمو معظم أنسجة الكالس في ظروف الإضاءة المنخفضة أو المظلمة ، حيث إنها غير قادرة على التصوير * ؛ تركيب.في الوقت نفسه ، يمكن أن يعمل الضوء كعامل يوفر عمليات التشكل وتفعيل العمليات للمرة الثانية.

!تكوين الوسائط الغذائية المستخدمة في زراعة الخلايا والأنسجة (بعد RG Butenko ، 1999)	تركيز وسائط المغذيات ، ملغم / لتر
مكون الوسائط	Murashige و	Gamborg و	أبيض،	نيش ونيش ،
	سكوج ، 1962	إيفيليجا ، 1968	1939	1974-1975
KN03	1900	3000	81	950
NH4NO3	1650	—	—	720
كاليفورنيا (N03)2	—	—	142	—
كاليفورنيا (N03)2-4 ح20	—	—	—	—
(NH4)2S04	—	134	—	—
ملغ 04-7 ح20	370	500	74	185
كاكل2ح20		—	—	166
كاكلص2 ح20	440	150	—	—
KC1		—	65	—
KH2P04	170	—	12	68
ناه2P04ح20	—	150	—	—
MnS04ح20	—	10	—	—
MnS0 „-4H20	22,3	—	—	25
ZnS04-4 ح20	8,6	—	—	—
ZnS04-7 ح20	—	2	—	10
ح3ب 04	6,2	3	—	10
النحاس 04-5 ح20	0,025	0,075	—	0,025
نا2Mo04-2H20	0,25	0,25	—	0,25
CoCl2-6 ح20	0,025	—	—	—
FeS04-7 ح20	27,8	—	—	27,8
Na EDTA-2H20	37,3	—	—	37,3
سيكسترين 330 Fe		28	—	—
التهاب العضلة الوسطى	100	—	—	200
حمض الاسكوربيك	—	—	—	3
الثيامين-HCl	0,5	—	—	3
البيريدوكسين-HCl	0,5	—	—	1
حمض النيكوتينيك	0,5	—	—	—
السكروز	30 000	20000	2000	60 000
أجار "ديفكو" ، جل	—	—	—	7000
ريث ، الاغاروز

التوليف. تستخدم مصابيح الفلورسنت كمصدر للضوء. بالنسبة لمعظم النباتات العشبية ، تبلغ الإضاءة المثلى حوالي 1000 لوكس. الإضاءة المنخفضة جدًا (300 لوكس) أو العالية (3000-10000 لوكس) تمنع النمو. يمكن أن تؤثر الإضاءة على عملية التمثيل الغذائي لخلايا الكالس. وهكذا ، في مزارع نبات الشاي ، زاد التخليق الحيوي للبوليفينول تحت تأثير الضوء. على العكس من ذلك ، في زراعة الخلايا سكوبوليا بارفي- فلورا قمع الضوء تشكيل قلويدات. بالإضافة إلى شدة الإضاءة ، تؤثر جودة الضوء على زراعة الأنسجة وخصائصها الفسيولوجية. وهكذا ، يتم تكوين أكثر من 20 فلافون وفلافونول جليكوسيدات في مزارع خلايا البقدونس بعد إضاءتها بضوء متوهج مستمر "أبيض بارد". وفي نفس الوقت ، يتم تنشيط تخليق جليكوسيدات الفلافون عن طريق الإشعاع المتتالي بالأشعة فوق البنفسجية ، ثم بواسطة الضوء الكاذب في منطقة "الموجة الحمراء الطويلة الحمراء"

درجة حرارة. بالنسبة لمعظم مزارع الكالس ، تكون درجة الحرارة المثلى 26 درجة مئوية. في الوقت نفسه ، تنمو مزارع الخلايا والخلية في دالية الديوسكوريا جيدًا حتى عند درجة حرارة 32 درجة مئوية. في على عكس نمو الخلايا والأنسجة المزروعة ، فإن تحريض تشكلها يتطلب درجات حرارة منخفضة (18-20 درجة مئوية). تأثير درجة الحرارة على استقلاب الخلية في المختبر تمت دراستها بشكل سيئ. هناك دليل على أن أقصى تكوين للقلويدات في مزارع الكالس لوحظ عند درجة حرارة 25 درجة مئوية ، ومع زيادة درجة الحرارة ، انخفض بشكل حاد. في مزارع الخلايا المعلقة إيبومويا يزداد محتوى الأحماض الدهنية بشكل كبير إذا نمت في درجات حرارة دون المستوى الأمثل (15 درجة مئوية) لذلك ، عند زراعة مزرعة في المختبر من الضروري دراسة تأثير جميع العوامل اللاأحيائية بعناية ، بما في ذلك درجة الحرارة ، على نمو الخلايا واستقلابها.

تهوية. بالنسبة لزراعة المحاصيل المعلقة ، فإن التهوية لها أهمية كبيرة. من المهم بشكل خاص تزويد الخلايا المستنبتة بالهواء بكميات كبيرة من المخمرات.

عند مقارنة أنواع مختلفة من المخمرات ، تبين أن تخليق المستقلبات الثانوية في ثقافة التعليق كان أكبر عندما تم توفير الهواء من الأسفل. عند نمو الخلايا في أحجام صغيرة (في قوارير) ، يتم تحقيق التهوية الطبيعية مع التحريك المستمر للتعليق.

رطوبة. الرطوبة المثلى في الغرفة التي أزرع فيها يجب أن تكون المحصول 60-70٪.

وبالتالي فإن زراعة الخلايا والأنسجة تعتمد على العديد من عوامل البيئة الخارجية ، وعملها ليس جيدًا دائمًا؟ stno. لذلك ، عند إدخال أنواع نباتية جديدة في الثقافة ، فمن الضروريتي بادئ ذي بدء ، من الضروري دراسة تأثير العوامل الفيزيائية بعناية على النمو والخصائص الفسيولوجية لهذه الثقافة.

تسمى زراعة الخلايا والأنسجة المعزولة على وسائط مغذية اصطناعية تحت ظروف معقمة (في المختبر) طريقة زراعة الأنسجة المعزولة.

نظرًا لحقيقة أن نباتات البذور لها أهمية قصوى في حياة الإنسان ، فقد تم تطوير طرق وظروف زراعتها بشكل أفضل من عاريات البذور أو الطحالب ، التي تسبب زراعتها في ظل ظروف معقمة بعض الصعوبات. ومع ذلك ، بغض النظر عن انتماء النباتات إلى مجموعة تصنيفية معينة ، هناك متطلبات عامة لزراعة الأشياء في الثقافة في المختبر.

عقم. بادئ ذي بدء ، زراعة أجزاء من الأنسجة أو عضو من النبات - إإكسبلنتس، والأكثر من ذلك بالنسبة للخلايا الفردية ، تتطلب عقمًا كاملاً.الكائنات الحية الدقيقة التي يمكن أن تدخل وسط المغذيات تطلق سمومًا تمنع نمو الخلايا وتؤدي إلى الموت ، لذلك ، أثناء جميع التلاعب بالخلايا والأنسجة أثناء الزراعة في المختبر ، يتم ملاحظة بعض القواعد المعقمة.

بيئة مزارع. تُزرع الخلايا والأنسجة المعزولة على وسائط مغذية متعددة المكونات. يمكن أن تختلف اختلافًا كبيرًا في تكوينها ، ومع ذلك ، فإن تكوين جميع الوسائط يشتمل بالضرورة على العناصر الدقيقة والعناصر الدقيقة اللازمة للنباتات والكربوهيدرات والفيتامينات والهرمونات النباتية ونظائرها الاصطناعية. يتم تضمين الكربوهيدرات (عادة السكروز أو الجلوكوز) في أي خليط مغذي بتركيز 2-3٪. إنها ضرورية كعنصر غذائي ، لأن معظم أنسجة الكالس تفتقر إلى الكلوروفيل وليست قادرة على التغذية الذاتية. لذلك ، يتم تربيتها في ظروف الإضاءة المنتشرة أو في الظلام. يجب أن تكون المكونات الإلزامية لوسائل الإعلام الثقافية هي العوامل المساعدة التي تسبب عدم التمايز الخلايا الجذعية والسيتوكينينات التي تحفز انقسام الخلايا. عندما تتغير النسبة بين هذه الهرمونات النباتية أو عند إضافة هرمونات نباتية أخرى ، فإن أنواع مختلفة من التشكل.

العوامل الفيزيائية. يتأثر نمو وتطور الأنسجة النباتية في المختبر بشكل كبير بالعوامل الفيزيائية - الضوء ودرجة الحرارة والتهوية والرطوبة. يمكن أن تنمو معظم أنسجة الكالس في ظروف الإضاءة المنخفضة أو المظلمة لأنها غير قادرة على التمثيل الضوئي. في الوقت نفسه ، يمكن أن يعمل الضوء كعامل يوفر التكوين وتفعيل عمليات التوليف الثانوي. بالنسبة لمعظم مزارع الكالس ، تكون درجة الحرارة المثلى 26 درجة مئوية. بالنسبة لزراعة المحاصيل المعلقة ، فإن التهوية لها أهمية كبيرة. من المهم بشكل خاص تزويد الخلايا المستنبتة بالهواء بكميات كبيرة من المخمرات. يجب أن تكون الرطوبة المثلى في الغرفة التي تنمو فيها المحاصيل 60-70٪. وبالتالي ، فإن زراعة الخلايا والأنسجة تعتمد على العديد من العوامل البيئية ، وتأثيرها ليس دائمًا معروفًا جيدًا. لذلك ، عند إدخال نوع نباتي جديد في ثقافة ما ، من الضروري أولاً وقبل كل شيء أن تدرس بعناية تأثير العوامل الفيزيائية على النمو والخصائص الفسيولوجية لهذه الثقافة.

تاريخ الإضافة: 2016-06-02؛ وجهات النظر: 493؛

شاهد المزيد:

عملية النمو الخلايا و الأقمشة على وسائط المغذيات الاصطناعية في ظل ظروف معقمة (في المختبر) تسمى طريقة للحصول على ثقافة الأنسجة المعزولة. عادة ما تكون زراعة الأنسجة المعزولة الكالس وأقل من ذلك بكثير أنسجة الورم (الشكل 3.1 و 3.2).

ثقافات الخلايا والأنسجة المعزولة.

استخدام مزرعة من الخلايا والأنسجة المعزولة.

تستخدم مزارع الأنسجة المعزولة على نطاق واسع في الزراعة والإنتاج الصناعي. لديهم مزايا مقارنة بالمواد النباتية التقليدية (النباتات البرية والمزروعة بالمزارع) وهي:

1. الاستقلال عن الظروف الخارجية.

2. تحسين ظروف النمو.

3. أتمتة العمليات وحوسبتها.

4. القدرة على زراعة أنواع نباتية مهددة بالانقراض.

5. إمكانية التكاثر الدقيق النسيلي لنباتات الفاكهة والخضروات ونباتات الزينة.

6. الشفاء من الالتهابات الفيروسية وغيرها.

7. الفرصة من خلال الثقافة في المختبر، توسيع مجالات التربية ، أي الحصول عليها الحيوانات المستنسخة الخلايا ، ثم النباتات ذات الخصائص المبرمجة.

بسبب قدرة الخلايا على التوليف في الثقافة المستقلبات الثانوية، نشأ فرع جديد من الصناعة ، يقوم بالتخليق البيولوجي للمواد اللازمة للإنسان.

شروط زراعة الأنسجة والخلايا.

زراعة شظايا نسيج أو نبتة واحدة - إإكسبلنتس، والأكثر من ذلك بالنسبة للخلايا الفردية ، تتطلب عقمًا كاملاً.

تفرز الكائنات الحية الدقيقة التي يمكن أن تدخل وسط الاستزراع السموميثبط نمو الخلايا ويؤدي إلى الموت. لذلك ، كل التلاعب بالخلايا والأنسجة أثناء الزراعة في المختبر نفذت وفقًا لقواعد معينة من التعقيم في صندوق رقائقي أو في غرف معقمة. يتحقق التعقيم عن طريق توفير الهواء المعقم الذي يمر عبر المرشحات ، ويوجه من الصندوق الرقائقي إلى الخارج. على سطح الأنسجة النباتية هناك دائما نبتة نباتية. لذلك ، فإن التعقيم السطحي ضروري ، ويتحقق ذلك من خلال معالجة مناطق النباتات التي سيتم عزلها عنها إإكسبلنتسالمطهرات (بيروكسيد الهيدروجين ، كلوريد الزئبق).

للعمل مع المواد البيولوجية ، فإن المكونات التالية مطلوبة:

- أطباق نظيفة ومفاعل حيوي (تخمير) ؛

- وسط غذائي معقم ؛

- الإضاءة المثلى ؛

- درجة الحرارة المثلى

- الرطوبة المثلى

- تهوية.

تنظيف الأطباق والتخمير. يتم تعقيم الأدوات والصوف القطني المغلف مسبقًا بالورق أو الرقائق بالحرارة الجافة فيه خزانة تجفيف عند درجة حرارة 160 درجة مئوية لمدة 1.5-2 ساعة.

عند استخدام أنواع مختلفة من المخمرات ، وجد أن الخصائص الفسيولوجية للثقافات يمكن أن تتغير ؛ لذلك ، يجب أن يتم تركيب المستقلبات الثانوية في ثقافة التعليق بإمداد الهواء من الأسفل. في ظل هذه الظروف ، يستمر التوليف بنشاط أكبر (الشكل 3.3).

عند نمو الخلايا بأحجام صغيرة ، على سبيل المثال ، في القوارير ، يتم تحقيق التهوية الطبيعية مع التحريك المستمر للمعلق.

بيئة مزارع... تتم زراعة الخلايا والأنسجة المعزولة في مكونات متعددة وسائط المغذيات... يمكن أن تختلف اختلافًا كبيرًا في تكوينها ، ومع ذلك ، فإن تكوين جميع الوسائط يتضمن بالضرورة مكونًا الأساس، والتي تضاف إليها مجموعات المواد الضرورية للنباتات: العناصر الكبيرة والصغرى والكربوهيدرات والفيتامينات والهرمونات النباتية. هذه القاعدة المكونة هي أجار أجار - عديد السكاريد من الأعشاب البحرية ، قادر على تكوين المواد الهلامية في الماء التي تصلب عند 45 درجة مئوية. يمكن إضافتها إلى وسط الثقافة السويداء الأجنة غير الناضجة (جوز الهند ، كستناء الحصان) ، شراب مركز بعض الأشجار مختلفة مقتطفات (الشعير والخميرة) وعصير الطماطم. إدخالهم في البيئة يعطي نتيجة إيجابية. ومع ذلك ، فإن كل مكون نشط له خصائص تكنولوجية متأصلة فيه فقط.

أرز. 3.3 مفاعل حيوي (التخمير) لنمو الكائنات الحية الدقيقة أو الخلايا أو الأنسجة

التمايز هو أساس عملية تشكيل الكالس.

Dedifferentiation هو عودة الخلايا المتخصصة إلى الحالة الإنشائية عندما تكتسب القدرة على الانقسام.

تعمل أعضاء وأنسجة النباتات كمواد أولية للحصول على مزارع من الخلايا والأنسجة ، ومع ذلك ، غالبًا ما تستخدم أوراق النبات لهذا الغرض.

يتم وضع جزء الورقة المعقمة الذي تم عمله مسبقًا على وسط مغذي صلب. تتكون الأوراق من أنسجة مختلفة ، تتمايز خلاياها وتصنع جزيئات مختلفة من البروتينات والكربوهيدرات والدهون والمواد الأخرى المميزة لهذه الخلايا. هذه الخلايا المتمايزة لا تملك القدرة على الانقسام.

في عملية التلف الميكانيكي للورقة يتم تحرير النبات المستأصل ، وتحت تأثير الهرمونات النباتية المضافة إلى البيئة ، والأوكسينات والسيتوكينين الخلية غير متمايزة. تفقد مواد التخزين - النشا ، والبروتينات ، والدهون ، والعضيات المتخصصة ، والبلاستيدات الخضراء ، وما إلى ذلك. ونتيجة لذلك ، تكتسب جميع الخلايا خصائص مورفولوجية وفسيولوجية قريبة جديدة ، أي تصبح دشبذ (مقسم) خلايا. يتكون نسيج الكالس على الورقة المستأصلة.

أنواع مزارع الخلايا. اعتمادًا على طريقة وظروف الزراعة ، هناك عدة أنواع من مزارع الخلايا والأنسجة:

- ثقافة الكالس.

- ثقافة التعليق

- زراعة الخلية الواحدة.

لو زراعة يحدث ظاهريا على ال متوسطة المغذيات أجار، ثم يتم تشكيل نسيج الكالس. ليس لديها هيكل واضح ، ولكن يمكن أن تختلف في الكثافة. يحدد الأصل وظروف النمو ما إذا كان نسيج الكالس رخوًا أم متوسط ​​الكثافة أم كثيفًا.

الخصائص العامة لخلايا الكالس. تحتوي خلية الكالس على عدد من الخصائص المشتركة مع الكل زرع الخلايا... هذا هو تطور الخلايا ، ومقاومة بعض العوامل البيئية غير المواتية وخصائص أخرى. في الوقت نفسه ، أثناء زراعتها ، تكتسب خلايا الكالس خصائصها الفردية ، مثل عدم التزامن الفسيولوجي ، وعدم التجانس الجيني ، وبعض الخصائص الأخرى.

عدم التزامن الفسيولوجي يكمن في حقيقة أن الخلايا في كل لحظة تمر بمراحل مختلفة من النمو: بعضها ينقسم ، والبعض الآخر ينمو ، والبعض الآخر يتقدم في العمر بالفعل. لذلك ، عادة ما يتم تقييم الشيخوخة الفسيولوجية العامة لمجموعة خلايا الكالس من خلال حالة معظم الخلايا (الشكل 3.4).

أرز. 3.4. خلايا الكالس فيأرز. 3.5 خروج بروتوبلاست من خلال

تاريخ الإضافة: 2016-05-28؛ وجهات النظر: 1915؛

مقالات مماثلة: